ความคิดเห็นที่ 1 เลนขวาสุดคือ blue ที่เหลือคือ white ครับ เวคเตอร์เปล่ามีขนาด 2.7 kb Insert มีขนาดประมาณ 1 kb จากคุณ : Meta-Anima เขียนเมื่อ : 15 มิ.ย. 55 15:07:23

ความคิดเห็นที่ 2 ขนาดของ ladder ครับ แก้ไขเมื่อ 15 มิ.ย. 55 15:08:32 จากคุณ : Meta-Anima เขียนเมื่อ : 15 มิ.ย. 55 15:08:20

ความคิดเห็นที่ 3 เอิ่ม นั่น uncut plasmid เหรอครับ ไปหาเอ็นไซม์มาตัดเป็น linearized plasmid ก่อน แล้วเอามาดูใหม่ DNA ที่ยังเป็นวงอยู่เอามาวิ่งบนเจล เราจะไม่รู้ขนาดชัดเจนหรอกครับ เพราะมันมี supercoiled ที่วิ่งเร็วกว่าขนาดจริงด้วย อีกอย่างการเอามาตัดทำ restriction digestion mapping มันบอกได้คร่าวๆ ด้วย ว่าเกิดอะไรขึ้น มี insert จริงหรือเปล่า ถ้าเอาขนาดมาดูอย่างเดียวมันตอบอะไรแทบไม่ได้เลยนะ หรือไม่ก่อนสกัดพลาสมิด เอาโคโลนีมาทำ pcr ก่อน ดูว่าอันไหนมี insert ค่อยสกัดพลาสมิด เผื่อประสิทธิภาพในการโคลนของคุณเป็นหนึ่งในร้อย หนึ่งในห้าสิบ จะได้ไม่ต้องลงแรงสกัดทั้งห้าสิบโคโลนี ร้อยโคโลนีไงครับ จากคุณ : Geneticist เขียนเมื่อ : 15 มิ.ย. 55 15:56:30

ความคิดเห็นที่ 4 มีเทคนิคที่เรียกว่าการทำ size screening ใช้เวลาที่ได้ clone เยอะๆแต่ได้ ligate ไม่มาก สามารถ screen positive clone ได้ง่ายและเร็วกว่าทำ PCR (ประหยัดกว่าด้วย) กรณีนี้ใช้ blue-white selection แล้ว เลือกมาซัก 5-6 มาทำ PCR เลย แล้วเอาที่ positive ไปทำ restriction analysis ซ้ำอีกครั้ง จากคุณ : amscmu เขียนเมื่อ : 15 มิ.ย. 55 16:26:06

ความคิดเห็นที่ 5 ทำ colony pcr แล้วครับ ผลแปลกๆ เลยมาสกัดพลาสมิดดูคอนเฟิร์มอีกที ที่สกัดพลาสมิดได้ทีทั้งหมดเพราะมันขึ้นน้อยครับ ส่วน size screening ไม่มีตังซื้อ kit ครับ >< แก้ไขเมื่อ 16 มิ.ย. 55 01:10:51 จากคุณ : Meta-Anima เขียนเมื่อ : 16 มิ.ย. 55 01:10:26

ความคิดเห็นที่ 6 ถ้าทำ colony PCR positive มาแล้ว เลือกมาซักสามโคโลนีมาสกัดพลาสมิด (อ้อทำแล้ว) ทำ PCR ซ้ำอีกที ถ้า positive อีกก็ให้ทำ restriction analysis ครับ size screening การคัดเลือกโดยวิธี size screening ขั้นตอนการทำ คือ ใส่สารละลาย size screening buffer ลงใน 96 well plate ช่องละ  50 µl ใช้ไม้จิ้มฟันปลอดเชื้อจิ้มโคโลนีที่เจริญบนอาหาร LB low salt-Zeocin ลงในแต่ละช่องของ 96 well plate นำไปบ่มที่อุณหภูมิ 37˚ซ นาน 10 นาที เพื่อให้บัฟเฟอร์ทำงานและที่อุณหภูมิ   4˚ซ เป็นเวลา 10 นาที เพื่อตกตะกอนโปรตีนและสารพันธุกรรมของเชื้อ จากนั้นดูดสารละลายใสด้านบน 20 µl   ไปตรวจดูผลโดยวิธี agarose electrophoresis (ข้อ 3.4.2) เทียบขนาดกับ พลาสมิดที่ไม่มียีนสอดแทรก โดยโคลนที่ได้รับ พลาสมิดที่มียีนสอดแทรกจะมีขนาดใหญ่กว่า Size Screening buffer 0.292 g EDTA 2        g sucrose 0.5     g SDS 0.8     g NaOH 0.15   g KCl 0.1     g Bromophenol blue 200    ml dH2O เก็บไว้ที่ 4˚ซ ก่อนนำไปใช้อุ่นโดยไมโครเวฟ (อย่าให้เดือด) จากคุณ : amscmu เขียนเมื่อ : 16 มิ.ย. 55 13:38:15

ความคิดเห็นที่ 7 ไหนๆ ก็สกัดพลาสมิดมาแล้ว ก็เอามาทำ PCR ดูซิครับ แล้วผล PCR แปลกๆ นี่แปลกยังไงอ่ะครับ พอจะอธิบายได้มั้ยครับ จากคุณ : มอนตะทาโร่ เขียนเมื่อ : 16 มิ.ย. 55 14:21:59

ความคิดเห็นที่ 8 Blue ให้ผล Positive แอมป์ยีนได้ในไซส์ที่จะเอาเหมือน white ครับ - -" และบลูที่ใช้นี่เอามาจาก masterplate ด้วยครับ เพราะงั้นไม่ใช่ DNA ตกค้างตอนทำ ligation/transform แน่นอน - -" ตอนนี้เอาพลาสมิดมาทำก็ให้ผลแบบเดียวกัน เลยคงต้องย้อนยาวไปดูที่ primer ที่่ออกแบบอีกทีแล้วมั้งครับ =__= จากคุณ : Meta-Anima เขียนเมื่อ : 17 มิ.ย. 55 13:32:36